Tekoče biopsije uporabljajo krvno-tumorsko tkivo - za diagnosticiranje raka
Običajno se tumorji preiskujejo z biopsijami tkiva. Majhen vzorec vzamemo iz tumorja in genotipiziramo ali analiziramo za genetsko ličenje. Problem s tem pristopom je, da biopsijski tumorji lahko izzivajo. Poleg tega biopsija tumorja zagotavlja le posnetek tumorja.
Pisanje v Discovery Medicine leta 2015 Labgaa in soavtorji navajajo naslednje podatke o konvencionalni tumorski biopsiji:
Zaradi očitnih razlogov je težko spremljati razvoj tumorja s sekvenčno biopsijo. Tudi biopsija samo odraža eno samo mesto tumorja in zato verjetno ne predstavlja celotnega spektra somatskih mutacij v velikih tumorjih. Druga možnost bi bila pridobitev več biopsij za isti tumor, vendar se ta možnost ne zdi niti realna niti točna.
Tekoča biopsija vključuje merjenje cirkulirajoče DNA (ctDNA) in drugih stranskih tumorjev v vzorcih krvi, pridobljenih pri bolnikih z rakom. Ta nastajajoči diagnostični pristop obljublja, da je hiter, neinvaziven in stroškovno učinkovit.
Zgodovina tekoče biopsije
Leta 1948 sta francoski raziskovalci najprej identificirali ctDNA v krvi zdravih ljudi, Mandela in Métaisa. To odkritje je bilo pred svojim časom, in še desetletja kasneje je bila ctDNA nadalje raziskana.
Leta 1977 so Leon in sodelavci najprej ugotovili povečano količino ctDNA v krvi bolnikov z rakom.
Do leta 1989 so Stroun in sodelavci v krvi identificirali neoplastične (tj. Rakave) značilnosti. Po teh odkritjih je več drugih skupin odkrilo specifične mutacije supresorjev tumorjev in onkogenov, mikrosatelitne nestabilnosti in metilacije DNA, kar je dokazalo, da ctDNA sprosti tumor v cirkulacijo.
Čeprav vemo, da ctDNA, ki izhaja iz tumorskih celic, kroži v krvi, so izvor, hitrost sproščanja in mehanizem sproščanja te DNA nejasni, pri čemer raziskave dajejo nasprotujoče si rezultate. Nekatere raziskave kažejo, da bolj maligni tumorji vsebujejo več mrtvih rakavih celic in sproščajo več ctDNA. Vendar nekatere raziskave kažejo, da vse celice sproščajo ctDNA. Kljub temu se zdi verjetno, da rakavi tumorji sproščajo povečano raven ctDNA v krvi, s čimer ctDNA dober biomarker raka.
Zaradi težke fragmentacije in nizkih koncentracij v krvi je ctDNA težko izolirati in analizirati. Obstaja neskladje koncentracij ctDNA med vzorci seruma in plazme. Zdi se, da je krvni serum namesto krvne plazme boljši vir ctDNA. V študiji, ki so jo izvedli Umetani in sodelavci, je bilo ugotovljeno, da koncentracije ctDNA v primerjavi s serumom dosledno ostanejo nizke zaradi morebitne izgube cirkulirajoče DNA med čiščenjem, saj se med pripravo vzorca izločajo koagulacije in drugi proteini.
Po navedbah Heitzer in kolegov je tu nekaj posebnih vprašanj, ki jih je treba rešiti, da bi izkoristili diagnostični potencial ctDNA:
Najprej je treba standardizirati predanalitske postopke ... Izbira izolacijske metode, ki zagotavlja ekstrakcijo zadostne količine visokokakovostne DNA, je kritična in dokazano je, da preanalitični dejavniki vzorčenja in obdelave krvi močno vplivajo na donos DNA ... Drugič, eno najpomembnejših vprašanj je pomanjkanje usklajenosti metod kvantifikacije. Različne metode kvantifikacije, ... proizvajajo različne rezultate, ker so te meritve ciljne bodisi popolne ali samo ojačljive DNA ... Tretjič, manj je znano o izvoru in natančnem mehanizmu za sproščanje ctDNA, v večini študij pa so zmedeni dogodki, ki bi lahko prispevali k sproščanju ctDNA.
Ciljani in nepredvideni pristopi
Trenutno pri analizi krvne plazme (ali seruma) za ctDNA uporabljamo dva glavna pristopa. Prvi pristop je namenjen in išče specifične genetske spremembe, ki kažejo na tumorje. Drugi pristop je nenameren in vključuje analizo genoma, ki išče ctDNA, ki odseva rak. Druga možnost je, da se exome zaporedje uporablja kot stroškovno učinkovitejši, neprimeren pristop. Exomi so dele DNK, ki se prepisujejo, da naredijo proteine.
S ciljnimi pristopi se serum analizira za znane genetske mutacije v majhnem nizu mutacij voznika.
Mutacije voznikov se nanašajo na mutacije v genomu, ki spodbujajo ali "vozijo" rast rakavih celic. Te mutacije vključujejo KRAS ali EGFR .
Zaradi tehnološkega napredka v zadnjih letih so ciljni pristopi k analizi genoma za majhne količine ctDNA postali izvedljivi. Te tehnologije vključujejo ARMS (ojačevalni ognjevarni sistem mutacije); digitalni PCR (dPCR); kroglice, emulzije, ojačanje in magnetika (BEAMing); in globoko zaporedje (CAPP-Seq).
Čeprav je prišlo do napredka v tehnologiji, ki omogoča ciljni pristop, ciljni pristop usmerja le na nekaj položajev mutacij (vročih točk) in pogreša veliko mutacij voznika, kot so geni za supresorje tumorjev.
Glavna prednost nepredvidenih pristopov do tekoče biopsije je, da jih je mogoče uporabljati pri vseh bolnikih, ker se test ne zanaša na ponavljajoče se genske spremembe. Ponavljajoče se genske spremembe ne pokrivajo vseh vrst raka in niso specifični znaki raka. Kljub temu ta pristop nima analitične občutljivosti in celovita analiza tumorskih genomov še ni mogoča.
Opozoriti je, da je cena zaporedja celotnega genoma znatno padla. Leta 2006 je cena zaporedja celotnega genoma znašala približno 300.000 USD. Do leta 2017 so stroški padli na približno $ 1000 (USD) na genom, vključno z reagenti in amortizacijo strojev za sekvenciranje.
Klinična uporabnost tekoče biopsije
Prvotna prizadevanja za uporabo ctDNA so bila diagnostična in primerjala ravni pri zdravih bolnikih s tistimi pri bolnikih z rakom ali tistimi z benigno boleznijo. Rezultati teh prizadevanj so bili mešani, le nekatere študije kažejo znatne razlike, ki kažejo na rak, stanje brez bolezni ali ponovitev.
Razlog, zakaj je ctDNA mogoče uporabiti le nekaj časa za diagnosticiranje raka, je zato, ker iz tumorjev izhajajo različne količine ctDNA. Vsi tumorji "ne puščajo" DNA v isti količini. Na splošno so naprednejši in razširjeni tumorji v obtoku iztekli več DNK kot zgodnji, lokalizirani, tumorji. Poleg tega so različne vrste tumorjev razkosale različne količine DNA v obtok. Delež obtočne DNA, ki izhaja iz tumorja, je v različnih študijah in oblikah raka zelo različen, v obsegu od 0,01% do 93%. Pomembno je opozoriti, da je na splošno le malo manjša od ctDNA iz tumorja, preostanek pa iz običajnih tkiv.
Krožna DNK se lahko uporablja kot prognostični marker bolezni. Krožno DNK se lahko uporablja za spremljanje sprememb v raku sčasoma. Na primer, ena študija je pokazala, da je dveletna stopnja preživetja pri bolnikih s kolorektalnim rakom (tj. Število bolnikov še vedno živih vsaj dve leti po diagnozi s kolorektalnim rakom) in mutacije KRAS-a na hrbtni strani 100 odstotkov pri tistih brez dokazov o ustrezna krožna DNA. Poleg tega je možno, da se v bližnji prihodnosti lahko krožno DNK spremlja predrakavske poškodbe.
Krožno DNK se lahko uporablja tudi za spremljanje odziva na terapijo. Ker cirkulirajoča DNA daje boljšo splošno sliko genetske oblike tumorjev, ta DNA verjetno vsebuje diagnostično DNA, ki se lahko uporabi namesto diagnostične DNK, dosežene s samimi tumorji.
Zdaj pa si oglejmo nekaj konkretnih primerov tekoče biopsije.
Guardant360
Guardant Health je razvil test, ki uporablja sekvenciranje naslednje generacije, da profilira obtočno DNA za mutacije in kromosomske preureditve za 73 genov, povezanih z rakom. Guardant Health je objavil študijo, ki poroča o koristnosti tekoče biopsije v onkologiji. V študiji so uporabili vzorce krvi pri 15.000 bolnikih s kombiniranimi 50 vrstami tumorjev.
V večini primerov so rezultati testa tekočega biopsije poravnani s spremembami genov, ki so jih opazili pri tumorskih biopsijah.
Glede na NIH:
Guardant360 je identificiral enake kritične mutacije pomembnih genov, povezanih z rakom, kot so EGFR, BRAF, KRAS in PIK3CA, pri frekvencah, ki so bile zelo podobne tistim, ki so bile predhodno ugotovljene pri vzorcih biopsije tumorja, statistično povezanih s 94% do 99%.
Poleg tega so raziskovalci po NIH poročali o naslednjem:
V drugem delu študije so raziskovalci ocenili skoraj 400 bolnikov, od katerih so večinoma imeli pljučni ali kolorektalni rak, ki so imeli tako ctDNA v krvi kot rezultate DNA tumorskih tkiv in primerjali vzorce genomskih sprememb. Celotna natančnost tekoče biopsije v primerjavi z rezultati analize tumorske biopsije je bila 87%. Natančnost se je povečala na 98%, ko so bili vzorci krvi in tumorjev zbrani v 6 mesecih drug od drugega.
Zdravilo Guardant360 je bilo točno, čeprav so bile ravni obtočne DNA v krvi nizke. Pogosto je kirurška tumorska DNA dala samo 0,4 odstotka DNA v krvi.
Na splošno so raziskovalci Guardant z uporabo tekoče biopsije prepoznali tumorske markerje, ki jih lahko zdravijo zdravniki pri 67 odstotkih bolnikov. Ti bolniki so bili upravičeni do zdravljenja, ki jih odobri FDA, pa tudi preiskovalne terapije.
ctDNA in rak pljuč
Leta 2016 je FDA odobrila testiranje mutacije EGFR za kobas, ki se uporablja za odkrivanje mutacij EGFR v obtočni DNA bolnikov s pljučnim rakom. Ta test je bila prva tekočinska biopsija, ki jo je odobrila FDA, in identificirani pacienti, ki so lahko kandidati za zdravljenje s ciljnimi terapijami z uporabo erlotiniba (Tarceva), afatiniba (Gilotrif) in gefitiniba (Iressa) kot zdravljenja prve linije, in osimeritiniba (Tagrisso) zdravljenje v drugi liniji. Te ciljne terapije napadajo rakave celice s specifičnimi mutacijami EGFR .
Pomembno je, da zaradi velikega števila lažno negativnih rezultatov FDA priporoča, da vzorec biopsije tkiva vzame tudi od pacienta, ki ima negativno tekočo biopsijo.
ctDNA in rak jeter
V zadnjih 20 letih se je število ljudi, ki umirajo zaradi raka na jetrih, povečalo. Trenutno je rak jeter drugi najpomembnejši vzrok smrti zaradi raka na svetu. Ni na voljo nobenih dobrih biomarkerjev za odkrivanje in analizo raka jeter ali hepatocelularnega (HCC). Krožna DNA bi lahko bila dober biomarker za raka na jetrih.
Razmislite o naslednjem citatu Lagbae in soavtorjev o možnosti uporabe obtočne DNK za diagnosticiranje raka na jetrih:
Hipermetilacija RASSF1A, p15 in p16 je bila predlagana kot zgodnja diagnostična orodja v retrospektivni študiji, v kateri so sodelovali 50 bolnikov s HCC. Podatek štirih aberantno metiliranih genov (APC, GSTP1, RASSF1A in SFRP1) je bil prav tako preizkušen za diagnostično točnost, medtem ko je bila metilacija RASSF1A opisana kot prognostični biomarker. Kasnejše študije so analizirale ctDNA pri bolnikih s HCC, ki uporabljajo tehnologije globokega zaporedja .... Zgodovinsko je bilo ugotovljeno, da so v času prenosa krvi pri dveh nosilcih HBV brez predhodne anamneze HCC ugotovili aberantne številke DNK kopičenja, ki pa so med spremljanjem razvili HCC. Ta ugotovitev je odprla vrata za ovrednotenje spreminjanja števila kopij v ctDNA kot presejalno orodje za zgodnje odkrivanje HCC.
Beseda iz
Tekoče biopsije so zanimiv nov pristop k genomski diagnozi. Trenutno so nekaterim tekočim biopsijam, ki ponujajo celovito molekularno profiliranje, na voljo zdravnikom za dopolnitev genetskih informacij, pridobljenih iz biopsije tkiva. Obstajajo tudi nekatere tekoče biopsije, ki jih je mogoče uporabiti namesto biopsije tkiva - kadar biopsije biološke tkiva niso na voljo.
Pomembno je, da upoštevamo, da je v teku veliko tekočih preskusov biopsije, zato je treba izvesti še več raziskav, da bi se izognili terapevtski koristnosti te intervencije.
> Viri:
> Preskus krvi za genske spremembe tumorjev kaže obljubo, ki je alternativa biopsiji tumorja. NIH.
> Heitzer E, Ulz P, Geigl JB. Cirkulirajoča tumorska DNA kot tekoča biopsija za rak. Klinična kemija. 2015; 61: 112-123. doi: 10.1373 / clinchem.2014.222679
> Lagbaa J, Villanueva A. Tekoča biopsija pri raku jeter. Discovery Medicine. 2015; 19 (105): 263-73.
> Tekoča biopsija: uporaba DNA v krvi za odkrivanje, sledenje in zdravljenje raka. NIH.
> Umetani N, et al. Višja količina proste krožeče DNK v serumu kot v plazmi ne povzroča večinoma onesnažena tuja DNA med ločevanjem. Ann NY Acad Sci. 2006; 1075: 299-307.
> Wellstein A. Splošna načela v farmakoterapiji raka. V: Brunton LL, Hilal-Dandan R, Knollmann BC. eds. Goodman & Gilman's: Farmakološka osnova terapevtike, 13e New York, NY: McGraw-Hill.